小小肽|小麦肽的抗氧化与抗疲劳作用研究——杭州康源食品科技有限公司
小麦肽的抗氧化与抗疲劳作用研究
王倩倩1，杜鹃2，陈鸣2，冯凤琴1,*
(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310012；
2.杭州康源食品科技有限公司，浙江杭州310012)
摘要：目的：探讨小麦肽的体外抗氧化活性和体内抗疲劳作用。方法：通过H2O2诱导小鼠成纤维细胞L929构建氧化应激损伤模型，测定损伤后L929细胞的存活率、乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物(glutathioneperoxidedismutase,GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量，从细胞水平评价小麦肽的抗氧化作用。然后通过力竭游泳和自由泳实验，测定力竭游泳时间、乳酸(lacticacid,LA)、尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和肌糖原(muscleglycogen,MG)含量、SOD和GSH-Px)活力以及MDA含量，来评价小麦肽的体内抗疲劳和抗氧化作用。结果：小麦肽浓度在0.4、0.8mg/mL时对L929细胞的H2O2损伤有极显著的保护作用；与模型组相比，小麦肽浓度为0.6和0.8mg/mL时的LDH活力分别显著下降了20.79%和19.67%、SOD活力分别显著和极显著的提高了83.21%和95.19%、GSH-Px活力分别提高了28.69%和32.14%，MDA含量分别显著下降了25.91%和26.99%。体内抗疲劳实验表明，与对照组相比，2个剂量组的小鼠力竭游泳时间分别显著延长了72.93%和91.73%，LA含量分别极显著下降了24.65%和25.16%、BUN含量分别极显著和显著下降了19.74%和17.78%，MG含量分别极显著提高了48.63%和56.85%；体内抗氧化结果表明，2个剂量组的SOD和GSH-Px活力分别极显著提高了20.54%、25.91%和29.79%、35.77%，MDA含量分别极显著下降了23.08%和21.46%。Pearson相关性分析表明小麦肽的体内抗疲劳与抗氧化作用高度相关。结论：小麦肽具有显著的抗氧化和缓解疲劳作用，且抗氧化活性与抗疲劳作用高度相关。
关键词：小麦肽，小鼠，抗氧化，抗疲劳，自由基
StudyontheAntioxidantand
Anti-fatigueEffectofWheatPeptides
WANGQian-qian1,DUJuan2,CHENMing2,FENGFeng-qin1,*
(1.CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310012,China;
2.HangzhouKangyuanFoodScience&TechnologyCo.,Ltd,Hangzhou310012,China)
Abstract: Objective: To investigate the in vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of wheat peptides. Methods: The oxidative stress model was established by treating L929 cells with H2O2. Then the cell survival rate, the activity of lactic dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxide dismutase (GSH-Px), and the content of malondialdehyde (MDA) were measured to evaluate the antioxidant activity of wheat peptides in vitro. In addition, the exhaustive swimming and freestyle swimming test was assessed. Then the exhaustive swimming time, the content of lactic acid (LA), blood urea nitrogen (BUN), muscle glycogen (MG) and MDA, the activity of SOD and GSH-Px were measured to studied the anti-fatigue and antioxidant of wheat peptides in vivo. Results: The wheat peptides in the concentration range from 0.4 to 0.8 mg/mL could protect L929 cells against H2O2-induced oxidative damaged as indicated by highly significantly increased the survival rate. Compared to the model group, the activity of LDH of the wheat peptides at 0.6 and 0.8 mg/mL was significantly decreased by 20.79% and 19.67%, the activity of SOD was highly significantly and significantly increased by 83.21% and 95.19%, the activity of GSH-Px was increased by 28.69% and 32.14%, and the content of MDA was significantly decreased by 25.91% and 26.99%. Compared with the control group, the exhaustive swimming time of the wheat peptides at 2 and 8 mg/mL was significantly increased by 72.93% and 91.73%, the content of LA was significantly decreased by 24.65% and 25.16%, the content of BUN was highly significantly and significantly decreased by 19.74% and 17.78%, and the content of MG was highly significantly increased by 48.63% and 56.85%. At the same time, the activity of SOD and GSH-Px was highly significantly increased by 20.54% and 25.91%, 29.79% and 35.77%, and the content of MDA was highly significantly decreased by 23.08% and 21.46%. Pearson correlation analysis showed that the antifatigue effect of wheat peptides was highly correlated with its antioxidant activity. Conclusion: Wheat peptide had significant antioxidant activity and anti-fatigue effect, and the anti-fatigue effect of wheat peptide was correlated with antioxidant activity.
Key words: wheat peptides; mice; antioxidant; anti-fatigue; free radical
中图分类号：TS201.4文献标志码：Adoi:10.13386/j.issn1002-0306.2020100066
近年来，随着生活节奏的加快和社会压力的增大，大部分人都处于亚健康的状态，因此越来越多人开始通过各种运动方式来提升自己的身体机能。在正常情况下，合理的体育锻炼有助于身体更好的发挥功能。但由于自身条件的不同以及运动量的不合理，他们经常会因为过度的运动导致身体的不适，引起身体的疲劳，从而影响工作效率，甚至造成各种运动性损伤，危及损害身体健康[1]。关于运动性疲劳的机制有几种学说，包括耗竭学说、阻塞学说、自由基学说、内环境失调学说、保护性抑制学说和突变学说[2]。其中自由基学说认为机体在高强度或长时间运动时会产生过量的自由基，如羟基自由基和超氧阴离子自由基，过多的自由基会破坏体内氧化和抗氧化平衡，引起肝脏和骨骼肌线粒体的脂质过氧化损伤，最终导致疲劳[3]。因此保护机体不受氧化伤害是预防疲劳的有效方法[4-5]。外源性抗氧化物质能与内源性自由基相互作用，减少机体氧化损伤、增强机体抗氧化防御能力、减少疲劳产生。近年来，营养干预特别是多肽类营养保健品受到越来越多研究者的关注，大量研究表明多肽在缓解疲劳方面是安全有效的[6-8]。与蛋白质相比，多肽类补充剂能够被机体更快更好地吸收，且能够加快氨基酸、蛋白质和葡萄糖的利用速率[9]。
小麦肽是小麦蛋白经过酶解得到的结构片段，其氨基酸含量均衡，具有多种功能活性，如抗氧化[10-11]、解酒[12]、免疫调节[13-14]、降血糖[15]、保护肠粘膜[16]、促进胃粘膜修复[17]等。研究表明酶解产物的氨基酸组成可能与其生物活性有关[18]。小麦肽氨基酸组成中谷氨酸的含量最高，而谷氨酸中谷氨酰胺含量丰富[19]。谷氨酸对神经系统具有积极的作用并且在运动过程中是有用的[20]，谷氨酰胺是谷胱甘肽合成的重要底物，在机体的抗氧化体系中具有重要作用。运动性疲劳的产生和氧化应激之间存在着很大的关系，已经成为抗疲劳领域研究的热点。但目前关于小麦肽的功能活性研究主要集中在小麦肽的体外抗氧化方面，而对体内抗疲劳的研究较少。另外小麦肽作为一种新的食品原料来源尚未得到广泛应用。因此，我们以小麦肽为研究对象，利用H2O2诱导小鼠成纤维细胞L929氧化损伤，从细胞水平评价小麦肽的体外抗氧化活性，然后通过给予小鼠灌胃小麦肽30天，测定小鼠力竭游泳时间和与疲劳相关的生化指标，探讨小麦肽的抗疲劳作用，并探求体内抗氧化活性和抗疲劳作用之间的相关性，从氧化应激的角度来解释小麦肽的抗疲劳机制，以期为小麦肽作为功能性食品基料提供数据支持。
1材料与方法
1.1材料与仪器
小鼠成纤维细胞L929购买于中科院上海细胞库，L929细胞用RPMI1640培养基，含10%胎牛血清和1%双抗，在37℃、5%CO2的条件下培养，当细胞融合至80%以上后，进行传代。SPF级ICR雄性小鼠64只，体重约(20±2)g，实验动物许可证编号为SYXK(浙)2018-0012，由浙江中医药大学实验动物中心提供和饲养，自由进食标准颗粒饲料及饮水，保持环境温度(25±2)℃，光照周期12h:12h条件下适应性饲养一周后使用。乳清蛋白粉购于市场；胎牛血清浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI1640培养基、双抗(青霉素、链霉素)、0.25%胰酶上海源培生物科技股份有限公司；乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒南京建成生物工程研究所；其余化学试剂均为国产分析纯。
HH-6数显恒温水浴锅常州澳华仪器有限公司；PB-10pH计、BSA224S电子分析天平赛多利斯科学仪器有限公司；752型紫外-可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；Ultimate3000高效液相色谱仪美国赛默飞世尔科技有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机安徽中佳科学仪器有限公司；InfiniteM200Pro酶标仪瑞士帝肯集团公司；MCO-170AICUVDL-PCCO2细胞培养箱日本松下电器产业株式会社；DM500光学显微镜徕卡显微系统贸易有限公司。
1.2实验方法
1.2.1小麦肽的制备称取一定量的谷朊粉，调节料液的pH至8.0，添加0.4%蛋白酶，于50℃下酶解1.5h后置于沸水浴中灭酶30min，经浓缩、喷雾干燥制得小麦肽。
1.2.2小麦肽特性的测定
1.2.2.1氨基酸组成采用异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法[21]测定小麦肽的氨基酸组成。样品溶解于6mol/LHCl，然后于110℃水解24h后冷却，取6μL水解液置于离心管中，氮气吹干后加入10μL再干燥液，吹干后加入20μL衍生溶液混匀，室温静置20min后再次氮气吹干，加入50μL流动相B，混匀后加入450μL流动相A，过膜上机。
色谱条件：色谱柱为WelchAQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为0.1mol/L乙酸钠溶液(含3%乙腈和0.1%三乙胺)，流动相B为80%乙腈；流速1.0mL/min；柱温38℃；进样量20μL；检测波长254nm。
1.2.2.2相对分子质量分布采用凝胶过滤色谱测定小麦肽的相对分子质量分布[22]。色谱条件：色谱柱为TSKgelG2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；流动相为乙腈-超纯水-三氟乙酸(体积比45:55:0.1)；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量20μL；检测波长220nm。
1.2.3体外抗氧化活性的测定
1.2.3.1细胞损伤模型的建立选择对数生长期的L929细胞，稀释细胞个数为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔接种100µL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后，弃去旧培养基，然后进行分组：空白组不加细胞，只加培养基；对照组加入不含H2O2的培养基，实验组加入不同浓度的H2O2(40、80、120、160、200、250、300、350µmol/L)。24h后，用CCK-8法检测细胞存活情况，通过公式(1)计算细胞存活率。
1.2.3.2小麦肽对L929细胞生长的影响选择对数生长期的L929细胞，稀释细胞个数为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔接种100µL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。24h后，弃去旧培养基，然后进行分组：空白组不加细胞，只加培养基；对照组加入不含样品的培养基，实验组加入不同浓度的小麦肽(0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)。24h后，用CCK-8法检测细胞存活情况，通过公式(1)计算细胞存活率。
1.2.3.3小麦肽对H2O2诱导L929细胞损伤的保护作用选择对数生长期的L929细胞，稀释细胞个数为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔接种100µL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后，弃去旧培养基，然后进行分组：实验组加入不同浓度的小麦肽(0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL)；正常对照组和H2O2损伤组加入不含样品的培养基。培养24h后弃去旧培养基，H2O2损伤组和样品组加入300µmol/L的H2O2，正常组加入不含H2O2的完全培养基，作用24h后，用CCK-8法检测细胞存活情况，通过公式(1)计算细胞存活率[23]。
1.2.3.4抗氧化指标测定选择对数生长期的L929细胞，稀释细胞个数为5×104个/mL，接种于6孔板中，每孔接种2mL。培养24h后进行分组：正常对照组、H2O2模型组、不同浓度小麦肽组(0.4、0.6、0.8mg/mL)。细胞经过不同样品和H2O2处理后，收集细胞和培养液进行各指标的测定。分别用试剂盒提供的方法测定上清液中LDH活力，细胞内SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。
1.2.4抗疲劳实验
1.2.4.1动物分组及给药雄性ICR小鼠64只，体重约(20±2)g，按照体重随机分为4组，分别为对照组(蒸馏水，同等剂量)、阳性组(乳清蛋白，2mg/g/d)、小麦肽低剂量组(2mg/g/d)、小麦肽高剂量组(8mg/g/d)，每组16只，根据小鼠重量给予不同剂量的受试物，灌胃量按0.1mL/10g，每日1次，连续30d，灌胃期间自由取食和饮水。灌胃30d后，将每组的16只小鼠随机分为2个亚组(每个亚组8只小鼠)，即A组和B组，A组小鼠用于力竭游泳实验，B组小鼠用于自由泳实验测定抗疲劳相关生化指标。具体的动物实验设计如表1所示。
表1动物实验设计
Table1Experimentaldesignofanimals
1.2.4.2力竭游泳实验末次灌胃30min后，将每组中的A组小鼠用肥皂水洗去其体表油脂，然后在小鼠尾根部负荷5%体重的铅丝，放入水温25℃、水深约30cm的游泳箱中游泳。游泳期间若有躬腰停止、悬浮休息者，用玻璃棒搅动附近水流迫使其不停运动。用秒表记录自游泳开始至小鼠头部全部沉入水中7s不能浮出水面的时间，该时间作为小鼠的力竭游泳时间。
1.2.4.3疲劳相关生化指标测定末次灌胃30min后，将每个实验组中的B组小鼠眼球取血，静置15min后，离心取上清液，-80℃保存备用。然后将采血后的小鼠立即处死，取出肝脏和后腿肌肉，按照1:9的比例加入相应体积的生理盐水，磨匀浆后得到10%的组织匀浆液，-80℃保存备用。分别用试剂盒提供的方法测定小鼠血清中LA和BUN含量、肌肉中MG含量、肝脏中MDA含量、SOD和GSH-Px活力。
1.3数据处理
采用SPSS19.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析比较组间差异，结果以均值±标准差表示，数据图表用GraphPadPrism8.0软件制作。
2.1氨基酸组成和相对分子质量分布
图1小麦肽的相对分子质量分布
Fig.1Relativemolecularweightdistributionofwheatpeptides
肽的生物活性与其氨基酸组成相关。由表2可知，小麦肽含有18种肽的生物活性与其氨基酸组成相关。由表2可知，小麦肽含有18种氨基酸，总量为76.66%，表明小麦肽含有丰富的氨基酸组成。其中谷氨酰胺和脯氨酸是最主要的氨基酸，含量分别为22.91%和9.92%。而谷氨酰胺是一种重要的具有特殊营养作用的条件性必需氨基酸及肠道必需氨基酸，它在保护细胞膜的完整性、维持细胞活力及降低细胞氧化损伤方面具有积极的作用[24]。半胱氨酸含有可电离的硫醇基团，能够清除自由基并结合金属离子[25]；组氨酸结构上含有咪唑环，可以与金属离子和活性氧结合[26]；甲硫氨酸含有硫醚基团，对特定氧化剂有反应[27]；酪氨酸含有酚羟基，通过提供氢原子来清除活性氧[28]。因此，以上4种氨基酸被普遍认为具有抗氧化活性[29]。另外，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸这类支链氨基酸不仅可以明显改善运动能力，延缓运动过程中肌肉蛋白质的分解代谢，而且还能减少运动后乳酸的积累，从而延缓血乳酸引起的疲劳。由表2可知，小麦肽中具有抗氧化活性的半胱氨酸、组氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸这4种氨基酸含量为6.31%。同时，小麦肽中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸这3种支链氨基酸的含量较高为13.22%。因此，小麦肽富含抗氧化与抗疲劳活性的氨基酸，推测其可能具有一定的抗氧化与抗疲劳的潜能。
除了氨基酸组成，肽的生物活性也取决于其相对分子质量的分布，分子量小于3000Da的肽被认为比分子量大于3000Da的肽具有更好的抗氧化活性，这种较好的活性可能是由于分子量小的肽段具有高活性、易吸收和低毒性[30]。由表3可知，小麦肽相对分子质量小于3000Da的部分占70.56%，推测其具有一定的抗氧化效果。
2.2体外抗氧化
2.2.1小麦肽对H2O2诱导L929细胞损伤的保护作用
图2小麦肽对L929细胞氧化损伤的保护作用
Fig.2ProtectiveeffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cells
注：与对照组相比，*代表差异显著P＜0.05，**代表差异极显著P＜0.01；与模型组相比，#代表差异显著P＜0.05，
##代表差异极显著P＜0.01，图3同。
通过H2O2处理小鼠成纤维细胞L929制备氧化应激损伤模型，来探讨小麦肽的体外抗氧化活性。如图2A所示，与对照组相比，当H2O2浓度为300µmol/L作用24h时，细胞存活率为52.39%，因此选择该浓度的H2O2进行下一步实验。如图2B所示，与对照组相比，浓度在0.2~0.8mg/mL范围内的小麦肽对L929细胞均具有增殖作用，浓度为0.4mg/mL时对细胞的增殖作用最强，且差异极显著(P＜0.01)。当浓度大于0.8mg/mL时，小麦肽对L929细胞的增殖有一定的抑制作用。因此我们选择浓度为0.2~0.8mg/mL的小麦肽进行下一步实验。小麦肽对L929细胞氧化损伤的保护作用结果如图2C所示。与模型组相比，在H2O2损伤前24h加入0.2~0.8mg/mL的小麦肽均能提高L929细胞的存活率，且随着浓度的升高，细胞存活率随之增加。当小麦肽浓度为0.6mg/mL时，对L929细胞的保护作用最显著(P＜0.01)，此时细胞存活率比模型组的提高了45.62%。综合两组实验结果表明小麦肽浓度为0.4~0.8mg/mL时对H2O2诱导L929细胞氧化损伤的保护作用较显著(P＜0.01)。
2.2.2小麦肽对H2O2诱导L929细胞损伤的抗氧化水平的影响正常细胞经由H2O2处理后，细胞膜被破坏从而导致细胞内的LDH释放。因此，上清液LDH活力的高低可反映出细胞的损伤程度。由图3A可知，L929细胞经H2O2损伤后细胞培养液中LDH活力极显著升高了53.10%(P＜0.01)，说明模型建立成功。与模型组相比，小麦肽浓度为0.4、0.6和0.8mg/mL时LDH的活力分别减少了7.20%、20.79%和19.67%，且浓度在0.6mg/mL和0.8mg/mL时差异达到显著(P＜0.05)。SOD和GSH-Px是机体内主要的抗氧化酶，SOD催化活性氧分解生成H2O2和O2，GSH-Px催化H2O2分解生成H2O和O2，它们能直接反应机体的抗氧化水平。而MDA是自由基引起脂质过氧化的主要产物之一，可间接显示机体清除氧化产物能力和抗氧化活性[31]。由图3B和图3C可知，与模型组相比，小麦肽浓度为0.4、0.6和0.8mg/mL时SOD活力提高了23.55%、83.21%和95.91%，且在浓度为0.6mg/mL和0.8mg/mL时差异达到显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)；同时GSH-Px活力提高了11.38%、28.69%和32.14%，但差异均不显著(P＞0.05)。由图3D可知，3个浓度的小麦肽使得细胞内的MDA含量降低了10.52%、25.91%和26.99%，且在浓度为0.6mg/mL和0.8mg/mL时差异达到显著(P＜0.05)。体外抗氧化实验表明小麦肽具有抑制体内氧化应激的潜力。
图3小麦肽对L929细胞氧化损伤LDH、SOD、GSH-Px和MDA水平的影响
Fig.3EffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cellsontheSOD,GSH-Px,MDAandLDH
2.3.1体重变化由表4可知，在实验期间，各样品组与对照组小鼠的体重均有所增加，但体重变化无显著性差异。灌胃期间，小鼠无不良反应，体质量增加正常，精神状态良好，未发现异常或者死亡现象，表明灌胃小麦肽并不会影响小鼠的正常生长，对小鼠无毒副作用。
2.3.2小麦肽对小鼠力竭游泳时间和抗疲劳指标的影响
图4小麦肽对小鼠力竭游泳时间、乳酸、尿素氮和肌糖原水平的影响
Fig.4Effectofwheatpeptidesontheexhaustiveswimmingtime,LA,BUNandMG
注：与对照组相比，*代表差异显著P＜0.05，**代表差异极显著P＜0.01，图5同。
力竭游泳时间是评价抗疲劳能力的一种实验模型，它能够很好地评价小鼠的疲劳耐受能力，再现性较高[32]。由图4A可知，小麦肽低剂量组、高剂量组和乳清蛋白组小鼠的力竭游泳时间较对照组均有极显著差异(P＜0.01)，分别延长了72.93%、91.73%和64.66%，且高剂量组与乳清蛋白组有显著差异(P＜0.05)。另外，随着小麦肽剂量的增加，其力竭游泳时间也随着延长，表明在一定范围内，小鼠力竭游泳时间呈剂量依赖性。长时间的剧烈运动会增加肌肉的氧气消耗，导致机体相对缺氧，此时肌肉中的糖原会被分解产生乳酸，为机体提供能量。但大量的乳酸的产生则会影响机体内环境的酸碱平衡，引起肌肉酸痛，导致肌肉运动能力的下降。同时为了满足能量需求，蛋白质的代谢显著增加，使肝脏中的尿素水平明显增加，过量的尿素会在体内积累并对机体造成危害。BUN的含量在一定程度上可以反映机体的疲劳程度[33-34]。由图4B和4C可知，与对照组相比，小麦肽低剂量和高剂量组均使得小鼠肝脏中的LA含量极显著降低了24.65%(P＜0.01)、25.16%(P＜0.01)，同时BUN含量较对照组也极显著和显著降低了19.74%(P＜0.01)、17.78%(P＜0.05)，表明小麦肽可加快LA和BUN的清除速度，减少了代谢产物的堆积和体内蛋白质和氨基酸的分解代谢，具有改善能量代谢，加速疲劳消除的作用，从而提高了小鼠的运动耐力。糖原是体内储存能量的主要形式之一，能够与糖在机体内进行转化作用，肌糖原通过无氧酵解的途径直接将能量供给肌肉组织[35]。由图4D可知，小麦肽低剂量和高剂量组MG含量比对照组极显著提高了48.63%(P＜0.01)、56.85%(P＜0.01)。根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》，若1项以上(含1项)的运动实验和2项以上(含2项)的生化指标为阳性，可判定该受试物具有抗疲劳作用。小麦肽低剂量和高剂量组的运动指标和3项生化指标均呈阳性，说明小麦肽通过延长小鼠力竭游泳时间，降低运动小鼠血清中乳酸和尿素氮含量，减少运动引起的肌糖原消耗，具有显著的抗疲劳作用。
2.3.3小麦肽对小鼠肝脏抗氧化水平的影响
图5小麦肽对小鼠SOD、GSH-Px和MDA水平的影响
Fig.5EffectofwheatpeptidesontheSOD,GSH-PxandMDA
以往的研究表明，剧烈运动过程中消耗大量的能量，会使氧化系统和抗氧化系统失去平衡，产生过多的活性氧，如羟基自由基和超氧阴离子自由基，这些自由基极易引起骨骼肌与肝脏线粒体的脂质过氧化损伤，从而削弱抗氧化能力。在剧烈运动中，人体对氧气的需求会增加，骨骼肌的血流量也会改变。这些变化导致自由基的产生和肌肉稳态的紊乱，导致骨骼肌的氧化损伤，随后的炎症反应和细胞因子的产生，进一步导致肌肉疲劳[36]。因此，清除活性氧可能是缓解肌肉疲劳的主要机制之一。由图5A和5B可知，与对照组相比，小麦肽低剂量和高剂量组均使得小鼠肝脏中的SOD极显著提高了20.54%(P＜0.01)、25.19%(P＜0.01)，同时GSH-Px活力较对照组也极显著提高了29.79%(P＜0.01)、35.77%(P＜0.01)；由图5C可知，与对照组相比，小麦肽低剂量和高剂量组均使得小鼠肝脏中的MDA含量极显著降低了23.08%(P＜0.01)、21.46%(P＜0.01)。结果表明，小麦肽能够提高小鼠体内抗氧化酶的活力，清除因运动而产生的自由基，缓解疲劳，具有较强的体内抗氧化能力。
2.3.4体内抗氧化和抗疲劳的相关性分析我们将体内抗氧化指标和抗疲劳指标进行Pearson相关性分析[37]，得到结果如表5所示。从表中可以看到，各个处理组的SOD活力、GSH-Px活力与小鼠力竭游泳时间、MG含量呈正相关，与LA含量、BUN含量呈负相关；MDA含量与小鼠力竭游泳时间、MG含量呈负相关，与LA含量、BUN含量呈正相关。结果表明，小麦肽的抗疲劳活性与其抗氧化活性高度相关。
3结论
本研究通过H2O2处理小鼠成纤维细胞L929来制备氧化应激损伤模型，从细胞水平评价小麦肽的体外抗氧化活性，然后通过给予小鼠灌胃小麦肽30d，测定小鼠力竭游泳时间和与疲劳相关的生化指标，探讨小麦肽的抗疲劳作用，并探求体内抗氧化活性和抗疲劳作用之间的相关性。体外抗氧化结果表明，H2O2损伤导致L929细胞存活率降低，细胞上清液中LDH漏出量增多且能够显著造成细胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低及细胞脂质过氧化产物MDA的增加。但当提前加入小麦肽对样品进行预保护后，可通过提高细胞内SOD和GSH-Px活性、减少MDA含量，发挥其抗氧化作用。体内抗疲劳结果表明小麦肽通过延长小鼠力竭游泳时间，降低运动后LA及BUN的水平，增加MG的含量，提高内源性抗氧化酶体系的活力，减缓疲劳的发生。通过对体内抗氧化和抗疲劳相关性分析可知，抗氧化活性与抗疲劳能力高度正相关，因此后续可进行与氧化应激相关的信号通路进行验证。
参考文献
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